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一株尼罗罗非鱼病原菌的分离鉴定及药敏特性分析

  广东海大畜牧兽医研究院有限公司 潘忠超 石和荣/文图

细菌病爆发是造成罗非鱼经济损失的重要原因之一,而嗜水气单胞菌作为主要的病原菌之一,其发病率及耐药性也逐年增加。近年来,大量资料证明,嗜水气单胞菌可引发人类的食物中毒、败血症、?#38405;?#28814;、蜂?#28814;?#32455;炎及伤口感染,影响食物安全,是重要的“人-兽-鱼”共患病病原菌。今年4月,在广东广州一养殖场患病尼罗罗非鱼病灶处曾分离出一株细菌,经革兰氏染色镜检、ATB生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定分离株为嗜水气单胞菌,并经过了相关药敏抗性试验检测,以为该病害的预防提供参考。

一、?#29287;?#19982;方法

1.病鱼来源
发病罗非鱼样本采自广州一罗非鱼养殖场,体重250g~300g。

2.病原菌的分离与培养 
现场取发病罗非鱼,由罗非鱼的表面症状可知,其眼部凹陷(图1),鳃部充血严重(图2);解剖发?#27542;?#36947;无食、红肿、黏液增多,肝部有病变,有斑点(图3),在实验室无菌操作台上用75 %酒精棉球对采样鱼体表进行消毒,无菌取样器取病鱼的肝、脑、肾、肠组织及眼部,划线接种于血琼脂平板和TSA平板(图4)。28℃培养18 h后,挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养,纯化后的细菌用于生化分子鉴定及药敏检测。

3.病原菌鉴定
(1)病原菌形态学与生理生化鉴定
取血平板涂板(图4)后和TSB液体培养基中28 ℃培养24 h后的菌体,经?#31185;?#22266;定、革兰氏染色(图5),显微镜下观察菌体形态。生化鉴定采用法国梅里埃公司的ATB细菌鉴定系统进行其它的生化项目测定。
细菌病爆发是造成罗非鱼经济损失的重要原因之一,而嗜水气单胞菌作为主要的病原菌之一,其发病率及耐药性也逐年增加。近年来,大量资料证明,嗜水气单胞菌可引发人类的食物中毒、败血症、?#38405;?#28814;、蜂?#28814;?#32455;炎及伤口感染,影响食物安全,是重要的“人-兽-鱼”共患病病原菌。今年4月,在广东广州一养殖场患病尼罗罗非鱼病灶处曾分离出一株细菌,经革兰氏染色镜检、ATB生化鉴定以及16S rRNA基因序列分析,确定分离株为嗜水气单胞菌,并经过了相关药敏抗性试验检测,以为该病害的预防提供参考。

二、结果

1.细菌的分离培养及染色镜检
不同组织分离到的菌落形态基本一致。在TSA平板上28 ℃条件下培养24 h,?#35797;?#24418;、边缘整齐、中央隆起、表面湿润、光滑、颜色浅黄的菌落。在血平板上?#23454;?#22411;的β溶血环。经革兰氏染色,在油镜下均为革兰氏阴性杆菌,两端钝圆,直或略弯,单个或成双排列,无?#38405;ぃ?#22914;图7)。

2.生理生化结果

如表1所示,对分离菌株与标准的嗜水气单胞菌同时用生化分析仪进行鉴定。结果表明,病原菌的生理生化反应指征与嗜水气单胞菌标准菌株的结果一致,所以分离到的菌株应为嗜水气单胞菌。

3.分子鉴定
采用大肠杆菌、罗非鱼无乳链球菌和嗜水气单胞菌三个菌的PCR引物同时对病原菌进行扩增,并设阴性对照,结果(见图8),菌株经扩增得到大小为420bp左右的特异性条带,与嗜水气单胞菌的特异性条带一致,此鉴定结果也与文献报道结果基本一致。

4.药敏试验结果
对15种比较常规的抗生素进行抗性试验(表2),菌株对菌必治、环丙沙星、氧氟沙星、四环素以及恩诺沙星表现极敏感,对头孢氨?#23567;?#26032;霉素、氟苯尼考、阿莫西林、妥?#27982;?#32032;、卡那霉素和罗红霉素较敏感,对链霉素、青霉素、新生霉素不敏?#23567;?br />
三、?#33268;?br />
由于发病鱼的表观主要临床症状之一为眼球突出,且有临死前于水面打转或间歇性窜游的表现,因此也怀疑为链球菌病,革兰氏染色镜检也发现一种阳性球菌,经PCR鉴定为海豚链球菌。在致病性研究中也一起进行了攻毒试验,结果10尾鱼中仅有2尾死亡,说明该球菌的致病力比较弱,这说明嗜水气单胞菌是导致此次尼罗罗非鱼发病的主要致病菌,但临床感染中这种混?#32454;?#26579;的情况值得关注和防范。

嗜水气单胞菌广泛存在于水、土壤以及水生动物中,是条件性致病菌。本次网箱尼罗罗非鱼的发病即是由于转群引起,转入网箱前鱼体表现正常,无死鱼,转入网箱后开始发病,连续一周内,每天均有四五十尾鱼死亡。细菌分离鉴定后进行药敏试验,结果发现该菌株对菌必治、环丙沙星、氧氟沙星、四环素以及恩诺沙星表现极敏感,对头孢氨?#23567;?#26032;霉素、氟苯尼考、阿莫西林、妥?#27982;?#32032;、卡那霉素和罗红霉素较敏感,对链霉素、青霉素、新生霉素不敏?#23567;?#36825;一结果与以往的报道有较大差异,蔡完其等在发病罗非鱼的温和气单胞菌的病原研究和药敏试验中发现,丁胺卡那霉素对分离到的嗜水气单胞菌具有很好地抑菌效果,而对本研究中分离到的菌株却不敏感;董?#19994;?#31561;的研究发现,分离到的4株菌对丁胺卡那、链霉素极为敏感,对头孢噻吩不敏感,而本次分离到的菌株对头孢噻吩敏感,对丁胺卡那、链霉素不敏?#23567;?#36825;可能与不同地区的用药情况有关,但随着各种药物耐药程度的不断升高,建议临床以加?#25239;?#29702;,预防发病为主,用药?#26412;?#37327;采用轮换用药,避免一种药物长期应用,或是采用有好的抑菌效果的中药制剂。

随着人们对鱼类健康养殖的需求日益增加,使用疫苗预?#26639;?#31181;水产疾病的发生是目前研究的重点,然而疫苗菌株的选择及?#40092;?#30340;?#21015;?#26159;目前研究需要解决的重要问题,鱼类免疫不同于其他动物,通过腹腔注射进行免疫会耗费大量的人力物力,很难应用于实际生产,因此开发浸泡和口服疫苗是适用水产动物的最佳途?#19969;?#26412;研究分离到一株具有强致病性的嗜水气单胞菌,目前仅对其生化特性、药物敏感性和致病力进行了初?#25945;?#32034;,菌株的传代毒力、半数致死量及免疫原性等仍需进一步研究,但就其应用前景来说,可以为嗜水气单胞菌的疫苗开发奠定基础,提供?#40092;?#30340;候选菌株。
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